【摘要】 目的 通过血小板衍化生长因子（PDGF）对培养的皮层神经元损伤后超氧化物歧化酶（SOD）的影响，了解其对损伤神经元的保护作用。方法 培养的皮层神经元损伤后设立PDGF组、对照组和PDGF抑制组，检测SOD活性，并于损伤后的1、2、3、4天观察神经元的存活率。结果 PDGF组的SOD活性较对照组和PDGF抑制组明显增强（P<0.01）,同时PDGF组的损伤后的1、2、3、4天神经元的存活率较对照组和PDGF抑制组也明显增高（P<0.01）。结论 血小板衍化生长因子（PDGF）通过提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性对损伤神经元起保护作用。
血小板衍化生长因子(PDGF)是一种刺激结缔组织增殖与分化的肽类调节因子, 由多种细胞合成并释放,其除参与人体发育及各系统的病理生理过程外,还在创伤修复中有一定的作用。目前发现神经外科手术后或脑损伤修复过程中，伴随有局部PDGF-A链及PDGF-B链基团表达量的升高和其受体的上调,PDGF-A和PDGF-B链在哺乳动物的神经中均得到表达［1,2］,它们参于引导胚胎神经元细胞的分裂、增殖和分化，在人脑的发育过程中起相当大的作用［3,4］。PDGF-A链在胚胎的晚期出现在许多神经元中［5］; 体外实验证明PDGF使少突胶质细胞的脂类蛋白和髓鞘基础蛋白增加［6］,除此之外,PDGF还维持神经元的活性,并促进轴突的生长［7］。脑损伤后PDGF-B链在损伤周围神经元及巨噬细胞中的免疫活性反应增强［8］。为了更进一步了解PDGF在中枢神经损伤及修复中对神经元的保护作用，我们利用培养的皮层神经元损伤模型中血小板衍化生长因子（PDGF）对超氧化物歧化酶（SOD）的影响，了解其对损伤神经元的保护作用。
材料和方法
一. 分组
PDGF组：细胞损伤前24h,加入PDGF（ platelet-derived growth factor(西京医院神经外科实验室自备）于培养皿,使浓度分别为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml。
PDGF抑制组：除于细胞损伤前24h加入PDGF外,根据鱼精蛋白为PDGF受体的抑制剂,加入鱼精蛋白（上海第一生化药业公司）抑制PDGF和受体结合,使培养液的鱼精蛋白终浓度为10-8mol/L。
对照组：只用培养液。
二. 皮层神经细胞损伤模型
神经细胞培养成功后7-10d,进行实验,这时85-90%为神经元,其余为胶质细胞。损伤24h前将培养瓶中的细胞分别移至3个培养皿中,损伤后继续培养4d,用空气压力损伤,压力1.5MPa。
三 SOD测定
采用Oyanagui建立的亚硝酸盐形成法［9］，用试剂盒（上海）测定样品液中的SOD活力,测定时取粗酶提取液50μl,按试剂盒说明书操作。SOD活力定义为每毫升反应液中的SOD抑制率达50%时，所对应的SOD量为1个亚硝酸盐单位(Nu/ml)。
活力计算公式：SOD活力(Nu/ml)=A对- A测/ A对÷50%
A对：对照管吸收度A测：测定管吸收度对照管用等体积及蒸馏水代替
四 存活神经元计数
于损伤后的第1、2、3、4d,在10倍的光学显微镜下进行损伤细胞计数,神经元细胞体光滑,呈圆形或隋圆形，轴突完整被视为存活细胞。死亡神经元胞体皱折、形状不规则、轴突呈串珠状。计数5个视野,取均数。
五 统计学处理
数据以均数±标准差(x+s)表示,用SPLM对数据依不同情况进行t检验,方差分析等处理,显著性界限表示为：*P<0.05 **P<0.01
实验结果
一 PDGF对SOD同功酶活性的影响
PDGF在不同浓度下对ZnCuSOD及MnSOD的活性增高不同，当浓度达到50ng/ml时，便有明显增高(P<0.01)；当浓度达到100ng/ml以上时，可获得最大效应(表1)。
表1 不同浓度PDGF对SOD同功酶的增加作用(x+s n=4)
组 别 5 10 50 100 200（ng/ml）
CuZnSOD(Nu/mg) 4.2±0.3 5.4±0.5 41.3±1.2** 75.6±3.6** 78.2±4.0**
MnSOD(Nu/mg) 1.8±0.1 2.8±0.2 39.6±1.4** 87.2±4.0** 86.8±3.9**
PDGF在浓度100ng/ml时达到对SOD同功酶活性最大效应，与其他两组对比有较明显差异(P<0.01)。但PDGF抑制组与对照组比较则无明显差异(表2)。
表2 各组SOD同功酶活性
组 别 CuZnSOD(Nu/mg) MnSOD(Nu/mg)
PDGF组 75.6±3.6** 87.2±4.4**
PDGF抑制组 4.3±0.2 1.4±0.1
对照组 4.6±0.3 2.0±0.2
二 细胞存活百分比计数
计数细胞存活百分比显示，PDGF组在损伤后的1、2、3、4d均较其它两组对细胞的存活有明显的保护作用(P<0.01)(表3)。
表3 各组细胞存活百分比
组 别 1 d 2 d 3 d 4 d
PDGF组 88.2±0.3** 65.3±0.3** 45.5±0.2** 25.4±0.1**
PDGF抑制组 36.7±0.2 18.7±0.1 3.4±0.1 0
对照组 36.3±0.3 16.6±0.1 2.7±0.0 0
讨论
PDG-A链和PDGF-B链及其受体在脑组织中有着广泛的表达,并在脑外伤时表达增加,说明脑外伤后可发挥其生物学作用。本实验证明,在培养的中枢神经元机械性损伤时，PDGF能增加SOD同功酶的活性,并对神经元起保护作用。这种作用与PDGF在一定浓度下存在着依赖关系,当浓度达到100μg/ml以上时,其神经元的保护作用达到最大。PDGF主要为PDGF-BB,早期的研究表明PDGF-BB能和受体αα、ββ及αβ结合。在成熟的中枢神经系统中几乎不存在α受体，因此PDGF只能通过ββ、αα受体起作用。鱼精蛋白为碱性蛋白，能够拮抗PDGF与其受体结合,本实验发现鱼精蛋白拮抗组与对照组无明显差异。我们认为PDGF提高SOD同功酶活性是通过结合其受体途径而发生效应的,但其作用机理目前仍未明了。SOD同功酶为对抗脑外伤后自由基的最重要酶类之一,自由基引起的脑组织脂质氧化损害，主要发生在缺血后再灌注期。脑损伤后的缺血是一种不完全性缺血，有与缺血后再灌注相似的病理特点，加之又有脑出血和组织的原发挫伤等严重病理改变，因而病理性脂质自由基反应对脑组织的损害不仅可以很快发生，而且可能更为严重。脑损伤后血管内皮细胞的破坏、血管异常扩张渗透性增加等均与自由基有关，是引起伤后血流下降和脑水肿的原因之一。给予自由基清除剂甘露醇、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和环氧化酶抑制剂后，可使这种损伤性改变减轻。脑损伤后缺血和出血还能启动催化自由基反应增强，引起脂质过氧化损害，使细胞膜通透性改变。细胞内Ca2+超载而致使超氧化物包括自由基等产生增加［10］,自由基等损伤细胞膜通道，使Ca+2内流加剧，形成恶性循环致细胞损伤直至死亡。
本实验证明,在培养的中枢神经元机械性损伤时，PDGF能增加SOD同功酶的活性,减少超氧化物包括自由基等造成的脑组织的进一步损伤而对神经元起保护作用。其作用机理目前仍需进一步研究。
参考文献：
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6. McKinnon R.D, Matsui T,et al, FGF modulates the PDGF-driven pathway of oligodendrocyte development. Neuron 1990;5:603～614
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8. O.Motohashi, M.Suzuki,et al, Thrombin and TGF-beta promote human leptomeningeal cell proliferation in vitro, Neurosci.Lett.1995;190:105～108
9. Yshihiko Oyanagui, Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity. Analytical Biochem.1984;142:290～296
10. Mattson MP.Zhang Y.et al,Growth factors prevent mitochondria dysfunction,loss of calcium homeostasis and cell injury,but not ATP depletion in hippocampal neurons deprived of glucose.Exp.Neurol.1993;121:1～13
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